Способы выделения ДНК

Большинство современных методов выделения ДНК из тканей растительного и животного происхождения состоят из следующих этапов:

• разрушение клеточных стенок (при их наличии);
• лизис клеточных мембран;
• очистка от ингибиторов ферментативных реакций (ПЦР, рестрикции).

Разрушение клеточных стенок осуществляется механически перетиранием с оксидом кремния (или оксидом алюминия) или с использованием жидкого азота. Этот этап можно проводить непосредственно в лизис-буфере, используемом для разрушения клеточных мембран.

Лизис клеточных мембран происходит в лизис-буфере: под воздействием поверностно-активных веществ или хоатропных солей происходит разрушение липидного бислоя. В состав лизис-буфера могут входить протеиназа К, разрушающая протеины или РНКаза для удаления РНК (в больших количествах может ингибировать ПЦР и др. ферментативные реакции).

После разрушения клеточных стенок и лизиса мембран образуется мультикомпонентная смесь (раствор), содержащий, в том числе, ДНК.

После стадии лизиса возможны 2 основных принципиальных классических подхода для очистки целевой ДНК:

• очистка раствора с помощью методов органической экстракции (с помощью фенола, хлороформа) с последующим осаждением ДНК спиртами и растворением в воде и ТЕ-буфере;
• дифференциальная сорбция ДНК на твердом носителе (чаще всего силикагели с повышенным отрицательным зарядом или модифицированной поверхностью), после нескольких стадий отмывки сорбента с локализованной на его поверхности ДНК органическими растворителями ДНК смывается водой или ТЕ-буфером.

Каждый из этих подходов имеет свои достоинства и недостатки.

В первом случае ДНК получается высокомолекулярной (фрагменты молекул имеют длину более 15000 нуклеотидных пар), однако возможны значительные потери ДНК, остаточные загрязнения протеинами, фенолом и хлороформом – сильными ингибиторами ПЦР.

При использовании методов, основанных на нуклеосорбции ДНК имеет высокую степень очистки, однако, возможна ее сильная фрагментация, а остаточные количества сорбента в конечном растворе ДНК также могут ингибировать ферментативные реакции.

В настоящее время ведущими в мире разработчиками наборов и систем для выделения ДНК используется принцип сорбции ДНК на сорбенте, запрессованном в микроколонку для центрифугирования, существенным недостатком таких наборов являются их высокая стоимость и потери ДНК после многократных промывок колонки, необходимых для удаления примесей.

Далее приводится ряд протоколов классических методов экстракции и очистки ДНК из объектов растительного и животного происхождения.